质子化与ph值的关系是什么（PEI转染的原理与使用操作方法）

聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）是目前工业化、大规模瞬时转染表达重组蛋白或病毒载体领域使用最广泛的基因载体和转染试剂。PEI是阳离子聚合物中的一种，下面我们对阳离子聚合物与PEI转染的原理与使用的操作方法进行一个阐述。

阳离子聚合物

常见的阳离子聚合物（多聚物）包括聚乙烯亚胺（PEI）、聚氨基酯(PBAE)、壳聚糖（Chitosan）、聚丙烯胺（PAH）、二乙氨乙基葡聚糖（DEAE-dextran）、聚氨树枝状聚合物（PAMAM）等。

图1. 用于核酸递送常见的聚合物载体

阳离子聚合物转染的共同原理：聚合物把DNA包裹形成复合物，防止被DNase降解，然后附着在细胞膜上被内吞进入胞内，破裂释放后，DNA进入细胞质中，从而发挥一定的功能。阳离子聚合物和阳离子脂质体最大的区别在于其不含疏水部分而完全溶于水，并可以方便地进行化学修饰。

PEI的分类

PEI的结构可以写成是-(CH2CH2NH)n-。根据合成原料与工艺的差异，产物有支链PEI与直链PEI的差异，2者在应用上存在比较明显的偏好。支链PEI在力学性、加工性、成膜性、薄膜透光性方面更具有优势，广泛应用于造纸、石油、轻纺、建筑等领域，而直链PEI在真核细胞的基因转染方面更具有优势，已广泛应用于基因转染方面。

直链PEI，应用最广泛的主要有PEI25000与PEI40000（也有称PEIMAX），在HEK293和CHO等细胞中转染效率较高。PEI 40000与PEI 25000转染试剂相比，具有很多优点。包括：

1.溶解性：PEI 40000较易溶解，可直接在水中溶解，PEI 25000需要先把水调成弱酸性助其溶解，溶解后再用NaOH把pH调至中性；

2.操作性：PEI 40000操作简便，更易于使用，且比PEI 25000的转染效果好；

3.稳定性：PEI 25000含有4-11%的丙酰基残留，其能阻止聚合物主链与DNA结合。相较于PEI 25000，PEI 40000是完全脱落的结构，因此其性能始终高效如一。

PEI转染的原理

直链PEI单体中每3个原子含1个氮，形成胺基。每相隔二个碳原子，即每第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的质子海绵(proton sponge)体。这是PEI有较强的结合DNA和黏附细胞，能作为基因转导载体的重要原因。

图2. pH值与质子化关系

（源自：doi.org/10.1021/acs.macromol.0c01501）

PEI 能将 DNA 包裹成带正电荷的微粒，这些微粒可以黏合到带有负电荷的细胞表面残基，并通过胞吞作用进入细胞。一旦进入细胞，胺的质子化导致反离子大量涌入以及渗透势降低，在低pH环境中实现DNA胞内释放。最被接受的观点是PEI上未质子化的胺可以在与膜结合的细胞器（如溶酶体）中吸收氢离子，这将导致更多氢离子的流入，诱发渗透溶胀。而质子化胺之间的排斥引起PEI构象的改变，上述变化导致的渗透膨胀使囊泡释放聚合物与 DNA 形成的复合物进入细胞质。复合物拆解后，DNA 能自由的融合到细胞核中。

PEI转染使用操作方法

PEI转染试剂使用比较方便，对血清与抗生素兼容性强。

图3. PEI转染试剂操作步骤示意图

具体操作步骤范例如下（以贴壁293细胞的6孔板培养为例）：

01

接种细胞

为了提高转染效率，建议在转染前一天接种细胞，以转染时细胞密度在70%~80%为宜。

02

配置复合物

按照以下体系配制DNA-PEI核酸-转染试剂复合物：

1.对于每孔细胞，使用100 μL无血清培养基稀释2 μg目的DNA，充分混匀成DNA稀释液。

【注】无血清稀释液建议采用Opti-MEM或ddH2O

2.立刻向100 μL的DNA稀释液中加入4 μL的PEI 40000转染试剂，轻轻混匀。

3.在室温下孵育10~20 min，使得形成DNA-PEI的核酸转染试剂复合物。

03

转染细胞

1.在形成复合物过程中，移除细胞生长培养基，每孔中加入2 mL新鲜预热的完全培养基。

2.直接将100 μL DNA-PEI核酸-PEI复合物加入细胞中，摇动培养板，轻轻混匀。

04

检测结果

37 ℃，5% CO2培养箱培养，转染后最快5 h即可检测到转入基因的表达。请自行确定适合检测时间。

翌圣PEI使用的举例

01

重组蛋白表达

细胞：293F

细胞密度：2.0-3.0×106 cell/ml

培养条件：100 μg/ml青霉素-链霉素+SMM 293-T II无血清培养基+37°C、5% CO2

收获时间：5天后，收集培养基，通过Ni亲和层析和大小排阻层析纯化重组蛋白。

02

慢病毒包装

细胞：293T

收获时间：48h

PEI使用常见问题

Q1：多配置一点母液冻存起来是否会延长效期？

A：不建议冻存，储存液2-8℃保存3个月使用是没问题的。

Q2：转染后是否需要换液？

A：不需要换液，也可在转染后6-8h观察细胞状态后，决定是否有必要进行换液。

Q3：转染的时候是否需要无血清培养基培养？

A：制备复合物的时候需要使用无血清培养基，而加入细胞中的时候不要求无血清培养。